Không dùng thuốc cho người bệnh có tiền sử quá mẫn hoặc có phản ứng độc với kanamycin hoặc các aminoglycosid khác. Trong trường hợp chức năng thận suy giảm, thận không thể thải trừ có hiệu quả kanamycin và nồng độ kanamycin trong huyết thanh tăng lên nhanh, cần phải giảm liều để tránh độc. Phải luôn luôn thận trọng khi dùng kanamycin và chỉ nên dùng trong trường hợp nhiễm khuẩn nặng hoặc kháng thuốc do các loại vi khuẩn đã kháng các kháng sinh khác nhưng còn nhạy cảm với kanamycin.
Thận trọng khi dùng kanamycin cho người bệnh nhược cơ vì kanamycin có một ít hoạt tính giống cura. Vì vậy, đã có một số trường hợp ngừng thở hoặc suy hô hấp do tiêm kanamycin trong màng bụng. Thêm vào đó, bệnh lý thần kinh về cảm giác, vận động đã xảy ra khi dùng kanamycin tại chỗ trong phẫu thuật cột sống. Kanamycin làm giảm nhẹ trương lực cơ ở những người bệnh nhược cơ, vì vậy không được tiêm vào màng bụng trong phẫu thuật ở những người bệnh đã dùng thuốc phong bế thần kinh cơ.
Không dùng thuốc cho người mang thai. Đối với người cho con bú, kanamycin bài tiết vào sữa. Không thấy có ảnh hưởng tới trẻ bú mẹ, vì kanamycin hấp thụ kém qua đường uống. Tuy nhiên có 3 vấn đề cần phải lưu ý đối với trẻ bú mẹ: thuốc làm thay đổi hệ vi sinh đường ruột, ảnh hưởng trực tiếp đến đứa trẻ (dị ứng hoặc quá mẫn) và làm sai lệch kết quả nuôi cấy vi khuẩn khi có sốt cần thiết phải làm xét nghiệm này.
Cũng giống các aminoglycosid khác, phản ứng không mong muốn quan trọng nhất của kanamycin là gây độc với tai (sau khi dùng kéo dài tần suất của phản ứng này gặp khoảng trên 40%), phong bế thần kinh cơ, phản ứng quá mẫn và nhiễm độc thận. Ðộc tính với tai sẽ tăng lên khi kết hợp kanamycin hoặc aminoglycosid khác với vancomycin. Nếu xuất hiện ù tai hoặc các dấu hiệu nhiễm độc thính giác khác, phải giảm liều hoặc ngừng kanamycin. Ngoài ra, thuốc còn gây độc tính với tiền đình (xảy ra dưới 10% trường hợp điều trị với liều bình thường) và thường hồi phục sau khi ngừng thuốc.